巢式PCR-RFLP检测rs9263726位点的实验研究
Study on the Detection of rs9263726 Locus by Nested PCR-RFLP

作者: 钟柳英 :广东药科大学药学院,广东 广州; 张 泳 :广东药科大学临床医学院,广东 广州; 顾取良 , 何震宇 :广东药科大学生命科学与生物制药学院,广东 广州;

关键词: 巢式PCR-RFLPrs9263726位点别嘌呤醇个体化用药 Nested PCR-RFLP rs9263726 Locus Allopurinol Individualized Medication

摘要:
目的:rs9263726位点(G>A)之A等位基因是预测别嘌呤醇致严重不良反应风险的遗传标记,本研究旨在建立一种直接使用口腔上皮细胞进行PCR结合FokI酶切检测该位点基因型的方法。方法:自行设计扩增产物包含FokI内对照识别序列的引物,以样本的口腔上皮细胞粗处理物为模板,通过巢式PCR扩增跨越rs9263726位点的靶片段,进而根据PCR产物的FokI酶切图谱判断样本基因型。结果:所检样本均能扩增出预期大小的PCR产物,3种基因型的酶切图谱特征明显,且经测序验证结果一致。结论:初步建立了一种基于巢式PCR-RFLP检测rs9263726位点的改良方法,具有简便、快速、准确、低成本等特点。

Abstract: Objective: The A allele of rs9263726 locus (G>A) is a genetic marker for predicting the risk of serious adverse reactions caused by allopurinol. The purpose of this study is to establish a method to detect this locus using a combination of direct PCR from oral epithelial cells with
FokI restriction digestion. Methods: Using innovational self-designed primers, a target fragment spanning the rs9263726 locus and upstream containing the FokI internal control restriction site was amplified by nested PCR from crudely-treated oral epithelial cells, and the genotype of the samples was determined by FokI digestion restriction map of PCR products. Results: The PCR products of expected size could be amplified from all samples, and the digestion patterns of three different genotypes were clearly distinguished, which were consistent with the sequencing results. Conclusion: An improved method based on nested PCR-RFLP to detect rs9263726 locus has been preliminarily established. It is simple, rapid, accurate and at low cost.

1. 背景介绍

别嘌呤醇作为抑制尿酸生成的首选药物被广泛应用,但在临床实践中该药物有许多副作用,其中别嘌呤醇致严重皮肤不良反应(SCARs)不容忽视,如史蒂文斯–约翰逊综合征(SJS)、中毒性表皮坏死松解症(TEN)和药物超敏反应综合征(DRESS)等,病死率高达30% [1] [2]。大量研究表明,HLA-B*58:01等位基因与别嘌呤醇致严重不良反应(SCARs)有强相关性 [3] [4] [5] [6]。不同民族的人群中该等位基因的携带率具有一定的差异,且HLA等位基因的分布频率在南方民族中显著高于北方民族,但在不同性别间无显著性差异 [7],因此在痛风患者使用别嘌呤醇药物之前,有必要进行HLA-B*58:01等位基因的检测。

HLA (human leucocyte antigen)复合体是人类多态性最丰富的遗传系统,定位于第6号染色体短臂6p21.31区,长3600 kb,遗传特征主要有多态性、多基因型,其多样性决定了HLA等位基因的检测方法具有复杂性 [8]。越来越多的研究显示,位于6号染色体的银屑病易感基因1候选基因1 (Psoriasis susceptibility 1 candidate 1, PSORS1C1)的rs9263726位点和别嘌呤醇导致的SJS/TEN有很大关联 [9] [10],可替代难于分型检测的HLA-B*58:01基因,用于别嘌呤醇个体化用药的指导。

聚合酶链反应–限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)技术是最经典的SNP分型方法,常用于基因突变的快速检测 [11]。Keiko Maekawa [12]、曾大勇 [13] 等使用同样的PCR-RFLP法成功检测了rs9263726位点多态性(见表1),其以静脉血来源的DNA为模板,扩增260 bp的目的片段,用限制性内切酶FokI酶切分型。

传统PCR-RFLP检测基因型的主要不足之处在于酶切不完全的情况下,会残留PCR产物从而导致基因型误判 [14],具体到rs9263726位点,使用表1的引物,一个AA型样品,其完全酶切的条带为141 bp、119 bp,当酶切体系含有未发生酶切的260 bp的PCR产物时,将出现260 bp、141 bp、119 bp的条带,与杂合子GA的带型一致,从而被误判为GA型。

Table 1. The existing PCR-RFLP methods for detecting rs9263726 locus

表1. 已有的检测rs9263726位点的PCR-RFLP方法

本研究旨在对上述的传统方法加以改进,不提纯基因组DNA而是直接使用口腔上皮细胞粗处理物作为模板,以提高操作的简便性,同时通过合理巧妙地设计引物,在PCR产物中引入内对照酶切位点以提高分型的准确性。

2. 实验材料和仪器

2.1. 试剂

引物由北京擎科生物科技有限公司(广州)合成;聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司;庄盟50 bp Ladder和DNA marker I购自广州左臣生物科技有限公司;限制性内切酶FokI购自昂科生物医学技术(苏州)有限公司,测序由北京擎科生物科技有限公司(广州)完成。

2.2. 样本

采自广东药科大学本科生志愿者,均签署知情同意书,按照本实验室的样本处理流程处理后备用。

2.3. 主要仪器

BIO-RAD T100基因扩增仪购自上海伯乐生命医疗产品公司;DYY-6B型稳压稳流电泳仪和WD-9403F紫外仪购自北京市六一仪器厂;三用恒温水箱购自姚奥特仪表有限公司;北京大龙手动单道移液器式移液购自上海高致精密仪器有限公司。

3. 实验内容

3.1. 引物设计

根据GenBank中PSORS1C1基因全序列(登录号:NG_021348.1,其中28892位的碱基R为多态位点碱基,R = G或A)及db SNP数据库的序列信息,采用primer premier 5.0软件设计外引物对F1、R1和内引物对F2、R2,见图1。巢式PCR产物理论长度为388 bp,突变型等位基因A的PCR产物在多态位点含有限制性核酸内切酶FokI识别位点,野生型等位基因G的PCR产物在多态位点不含FokI识别位点,此外,两者均在多态位点上游含有一个天然的内对照酶识别位点(28743-28747位的catcc)。

3.2. PCR扩增

第一轮PCR:PCR反应体系为5 μl:口腔上皮细胞粗处理物0.5 μl,2×TransDirect® PCRSuperMix (+dye) 2.5 μl,外引物F1、R1各0.2 μl,ddH2O 1.6 μl。PCR反应条件为:94℃预变性8 min,94℃变性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸40 s,30个循环,72℃再延伸5 min。

第二轮PCR:PCR反应体系为25 μl:第一轮PCR产物0.2 μl,2×EasyTaqPCRSuperMix 12.5 μl,内引物F2、R2各0.2 μl,ddH2O 11.9 μl。PCR反应条件为:94℃预变性,3 min,94℃变性30 s,50℃退火30 s,72℃延伸15 s,30个循环,72℃再延伸5 min。

Figure 1. Schematic diagram of designing nested PCR outer and inner primers

图1. 巢式PCR外、内引物设计示意图

3.3. PCR产物鉴定

用胶染法制备含溴化乙锭(EB)的1.5%琼脂糖凝胶,取2 μl第二轮PCR产物于150 V电泳25 min,用紫外透射仪观察结果,并拍照保存。

3.4. PCR产物酶切消化

酶切反应体系为30 μl,其中PCR产物2 μl,10×FastDigestGreen Buffer 2 μl,FastDigest FokI 0.5 μl,ddH2O 25.5 μl,37℃水浴15 min。

3.5. 酶切片段电泳分型

用胶染法制备含溴化乙锭(EB)的2.5%琼脂糖凝胶,取18 μl酶切产物于180 V电泳25 min,用紫外透射仪观察结果,并拍照保存。

3.6. 3种基因型样品的测序验证

取3种基因型样品各1例,扩增388 bp的靶序列送至擎科基因公司测序,测序引物为上游内引物F2。

4. 实验结果

4.1. 巢式PCR产物电泳结果

图2的1~3号分别为3个不同样品的PCR产物电泳条带,条带单一,与预期产物片段大小(388 bp)相符,表明PCR取得成功。

M:DNA分子量标记Marker I,1~3为不同样本的PCR产物。

Figure 2. Agarose gel electrophoresis of the nested PCR products

图2. 巢式PCR产物琼脂糖凝胶电泳图

4.2. 酶切产物电泳结果

图3为本实验室保存的已知的3种基因型样品的酶切图谱。预期条带如下:

野生型纯合子GG:278 bp、110 bp

杂合子GA:278 bp、148 bp、130 bp、110 bp

突变型纯合子AA:148 bp、130 bp、110 bp

图3实验结果与预期完全一致。

图4为10个随机样品的酶切图谱,尽管PCR产物有不同程度的残留,但通过278 bp、148 bp两条特征条带仍然能分辨3种基因型。

4.3. 基因测序结果

PSORS1C1基因rs9263726位点附近的序列为……ACTCRTCCCCC……,3种基因型样品的测序结果与本法的分型结果完全一致,见图5,证明了方法的准确性。

M:DNA分子量标记Marker I,L:DNA分子量标记50 bp Ladder,P:PCR产物,1:AA型,2:GA型,3:GG型。

Figure 3. Electrophoresis of the FokI-digested nested PCR products of three different genotypes

图3. 3种基因型样品巢式PCR产物的酶切产物电泳图

M:Marker I,L: 50bpladderMarker,P:PCR产物对照;1-2、5、8:GG型,3、6-7、9-10:GA型,4:AA型。

Figure 4. Electrophoresis of digested products of 10 random samples

图4. 10个随机样品酶切产物电泳图

GG型(野生型纯合子) GA型(杂合子) AA型(突变型纯合子)

Figure 5. Sequencing peak map of three genotypes of rs9263726 locus

图5. rs9263726位点三种基因型样品测序峰图

5. 讨论

传统的限制性核酸内切酶识别序列一般为“回文”结构,且酶切位点位于识别序列处或者旁边。FokI酶属于限制性内切酶家族中的IIs型酶 [15]。特异性地识别DNA上特定的非对称识别位点 [16],即DNA上的特定序列5’-GGATG-3’或者前者的互补序列5’-CATCC-3’,然后非特异性地剪切一条链上距离识别位点9个碱基距离处的磷酸二酯键,另一条链(互补链)上距离识别位点13个碱基距离处的磷酸二酯键。rs9263726位点中28743~28747位的序列为FokI酶的识别序列,它是野生型等位基因G和突变型等位基因A都拥有的序列,可作为内对照识别序列,无论哪种等位基因来源的PCR产物都能在该识别位点对应的切割位点发生切割,从而可用作提示酶切的程度。在酶切完全的情况下,所有切割后的条带都应小于原来的PCR产物;如果出现PCR产物残留,则提示酶切不完全。在没有内对照酶切位点的情况下,酶切不完全残留的PCR产物会被当作G等位基因对待,造成AA型样品被误判为GA型样品;而本研究中即便酶切不完全、有PCR产物残留,也可通过特征条带对基因型进行判断,其中G等位基因的特征条带为278 bp,A等位基因的特征条带为148 bp,故图4的10个样品,虽然有PCR产物残留,但基因型都能正确判断。

本研究所用的FokI价格比较昂贵,公司网站报价为1019元/100次反应 (https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/FD0874#/FD0874),每次反应推荐用酶1 μl。为了节省实验成本,本研究中,把每个样品的酶切体系中的FokI的用量减半即改为0.5 μl,虽然会造成一定程度的酶切不完全,但丝毫不影响结果判断,有赖于巧妙的内对照酶切识别位点的设计。

值得一提的是,148 bp的条带是在多态位点和内对照酶切位点识别序列对应的切割位点均发生切割后形成的中间片段,FokI这种酶在酶切反应完成后很容易与DNA片段粘在一起,从而影响DNA片段对核酸染料的结合,造成该条带观察起来略显暗淡,但通过对图片的亮度、对比度加以调整或者对图片进行反色处理,是能够看得非常清楚的,而且它与5’端切割产生的130 bp片段有较好的区分度。

本研究前期的引物设计筛选过程中发现,如果将内引物对的下游引物设在现有的R2引物的下游(见图1之R3),部分PCR产物酶切后在得到预期条带的同时,还出现了一些非特异性条带。PCR产物测序的结果发现,图1之29035~29039位的基因组原碱基序列CGTCC在产物中变为了CATCC,从而形成了新的FokI识别序列,导致酶切条带出现异常。这提示运用PCR-RFLP法进行基因分型具有一定的局限性,设计的引物需经实践验证,以避免PCR产物中带有可能的突变而干扰基因分型。

6. 结论

本研究对现有的基于PCR-RFLP法检测rs9263726位点的方法进行了成功的改良,可以使用简便易得的口腔上皮细胞作为模板直接进行巢式PCR获得靶序列;靶序列带有FokI的内对照酶切识别序列,可提高RFLP分型的准确性,并且可以节省FokI的用量,降低成本;直接PCR和快速核酸内切酶的应用还能缩短检测周期。故本研究建立的方法在指导别嘌呤醇的个体化用药方面有良好的应用前景。

基金项目

1) 广东药科大学2018年教育教学改革项目。

2) 广东省2019年大学生创新训练项目(编号:S201910573027)。

NOTES

*通讯作者。

文章引用: 钟柳英 , 张 泳 , 顾取良 , 何震宇 (2021) 巢式PCR-RFLP检测rs9263726位点的实验研究。 生物过程, 11, 46-53. doi: 10.12677/BP.2021.113006

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