植物转录因子研究方法
Research Method of Transcription Factors in Plant

作者: 周蒋毅 , 周 倩 :浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江 金华;

关键词: 植物转录因子转录调控蛋白质与蛋白质互作靶基因与蛋白质互作Plant Transcription Factor Transcription Control Protein-Protein Interaction Target Gene-Protein Interaction

摘要:
植物转录因子可以调控众多下游基因的表达,在植物的生长发育、响应外界环境刺激等方面起着重要的调控作用。随着转录因子在模式植物和作物中基因转录调控的研究不断深入,转录因子研究方法也在持续创新。我们主要从蛋白质与蛋白质互作和靶基因与蛋白质互作这2个方面阐述植物转录因子研究方法,为植物转录因子的相关研究提供参考方法。蛋白质与蛋白质互作的方法主要有:酵母双杂交系统、荧光共振能量转移技术、双分子荧光互补技术、下拉实验和免疫共沉淀技术;靶基因与蛋白质互作的方法主要有:酵母单杂交系统、染色质免疫沉淀技术、凝胶电泳迁移技术和荧光素酶报告系统。

Abstract: Plant transcription factors regulate the expression of vast downstream genes and play an important role in the regulation of plant growth and development, as well as its response to environment. With the development of transcription factors in model plants and crops, the research methods of transcription factors are also being innovated. We describe the research methods of plant transcription factors from two aspects: protein-protein interaction and target gene-protein interaction, so as to provide a reference method for the related research of plant transcription factors. Protein-protein interaction methods include: yeast two-hybrid system, fluorescence resonance energy transfer, bimolecular fluorescence complementation, pull down and co-immunoprecipitation; methods for target gene-protein interaction include: yeast one-hybrid system, chromatin immunoprecipitation, electrophoretic mobility shift assay and luciferase reporter assay.

1. 引言

转录因子(Transcription Factor, TF)也称反式作用因子,其可直接或间接与基因启动子区域中顺式作用元件特异性结合、对基因转录进行调控的蛋白质 [1]。其主要功能是激活或抑制基因的转录效应。典型的转录因子一般具有4个功能结构域,即DNA结合结构域(DNA-Binding Domain)、转录调控结构域(Transcription Regulation Domain)、核定位信号区(Nuclear Location Signal)和寡聚化位点区(Oligomerization Site)。DNA结合结构域特异性结合顺式作用元件;转录调控结构域激活或抑制靶基因表达;核定位信号区是转录因子中富含精氨酸和赖氨酸残基的核定位区域,转录因子进人细胞核的过程受该区段控制;寡聚化位点区是不同转录因子借以发生相互作用的功能域。这些结构域共同调节靶基因的转录起始 [1] [2]。

转录因子在植物的生长发育及对外界环境刺激等方面发挥着重要的调控作用。从1987年Paz-AerS首次报道玉米转录因子基因的克隆以来,相继从高等植物中分离出的调控干旱、高盐、低温、激素、病原反应及生长发育等相关基因表达的转录因子已达数百种 [3]。植物中约有58个转录因子家族 [4],其中有6个转录因子家族据研究报道参与了生物和非生物胁迫反应,如AP2/ERF (APETALA2/乙烯响应因子),bHLH (基础螺旋–环–螺旋),MYB (与成髓细胞相关),NAC (无顶端分生组织(NAM)),拟南芥转录激活因子(ATAF1/2),杯状子叶(CUC2),WRKY和bZIP (碱性亮氨酸拉链) [5] [6]。

随着转录因子在模式植物和作物中基因转录调控的研究不断深入,转录因子研究方法也在持续创新。我们主要从蛋白质与蛋白质互作和靶基因与蛋白质互作这2个方面阐述植物转录因子研究方法。

2. 蛋白质与蛋白质互作

2.1. 酵母双杂交系统

酵母双杂交系统(Yeast two-hybrid system, Y2H)于1989年首次开发,彻底改变了寻找和鉴定互作蛋白的过程 [7]。该系统根据酵母GAL4转录因子的特性,由DNA结合结构域(Binding Domain, BD)和转录激活结构域(Activation Domain, AD)组成。DNA结合结构域由GAL4 N端1-147位氨基酸残基组成,转录激活结构域由C端768-881位氨基酸残基组成 [8]。这两个结构域之间由大的结构区域隔开,独立且功能稳定。一般情况下,单独的BD结合DNA上游激活序列(Upstream Activating Sequence, UAS)但不引起转录,单独的AD不能与UAS结合,只有当两个相互作用的蛋白质分别与BD和AD融合时,它们的相互作用产生嵌合型转录因子从而引起启动子下游基因的转录。

依据此特性,将编码已知蛋白(诱饵蛋白,Bait)的基因构建到含有BD序列的载体上,在酵母中表达产生融合蛋白BD-Bait,将编码未知蛋白(猎物蛋白,Prey)的基因构建到含有AD序列的载体上,在酵母中表达产生融合蛋白AD-Prey,当BD-Bait与AD-Prey在酵母核中相互作用时,DNA-BD和AD接近以恢复功能性GAL4转录激活因子,前者与报告基因(如lacZ、ADE2、HIS3和MEL1)的UAS结合,从而启动报告基因的表达 [8]。因此可以通过判断酵母克隆能否在与报告基因对应的营养缺陷型培养基上生长来证明两个蛋白是否存在相互作用。

与其它的研究蛋白质相互作用的方法相比,假阴性、假阳性以及互作蛋白的强制性核定位是Y2H的局限,当然Y2H有其独特的优点。首先,Y2H不仅可以检测稳定的相互作用蛋白,还可以检测弱而短暂的蛋白相互作用 [9]。第二,由于Y2H是在酵母细胞核内进行的,因此检测的蛋白质可能以天然构象存在 [8]。第三,Y2H是对生化方法(如免疫共沉淀和质谱分析)的补充 [9] [10]。近年来Y2H得到了很大的改进,不仅可以应用于蛋白质-DNA相互作用 [11] 和酵母三杂交 [12],还可以用于膜蛋白,DNA结合蛋白和RNA结合蛋白的相互作用研究 [13]。

2.2. 荧光共振能量转移技术

高端共聚焦显微镜和荧光蛋白的发展促进了亚细胞尺度的蛋白质分析。荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)是指处于激发态的供体荧光蛋白将能量以非辐射的方式转移到附近的受体分子 [14]。发生FRET必须有三个先决条件:1) 供体发射和受体吸收的光谱重叠区域必须有有效的能量转移;2) 荧光基团之间的距离必须小于10 nm;3) 荧光基团的双极取向必须以理想的平行方式对齐。虽然FRET常用于蛋白质相互作用,但其实际上是通过理论计算来检测 [15]。

有很多方法可以检测到FRET,每种方法都各有好处和缺陷。目前有三种最常用的技术:1) 敏化发射测量(FRET-SE);2) 受体光漂白(FRET-AB);3) 荧光寿命成像(FRET-FLIM)。

敏化发射测量(FRET-SE)主要用于动态检测活细胞中的FRET效率 [16]。FRET-SE的限制在于每次实验需要利用至少3个对照样本对光学检测系统以及荧光基团的光学性质进行事先校正,一旦校正完成,后续实验不能再改变任何系统参数,且每次实验都要重新校正,这极大地增加了实验的工作量和难度。

受体光漂白(FRET-AB)通过检测光漂白受体漂白前后供体的荧光强度来获得FRET效率 [17]。这是一种直接的方法,不需要高端显微镜,也不受光谱影响,可以自己控制样品。

荧光寿命成像显微术(FRET-FLIM)主要通过测量受体存在和不存在时的供体分子的荧光寿命来确定FRET效率 [18]。这是一种不受光谱,供体或受体浓度差异,激发强度变化和光漂白影响的技术 [19]。其限制因素主要是系统价格昂贵,而且需要熟练的操作人员进行操作。

2.3. 双分子荧光互补技术

双分子荧光互补技术(Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC)最初从大肠杆菌发展而来,后来广泛适用于哺乳动物和植物系统 [20]。其原理是将荧光蛋白在合适的位点切开形成不发荧光的N端和C端片段,这2个片段借助融合于其上的目标蛋白的相互作用,彼此靠近重新形成具有活性的荧光蛋白,并在该荧光蛋白的激发光激发下发射荧光。尽管BiFC被广泛应用,但它受到两个主要限制:1) 估计半衰期为10年的分裂荧光蛋白片段的不可逆互补排除了相互作用动力学的分析;2) 大多数分裂片段可以不受阻碍地自发重新组装。这些缺陷增加了假阳性的可能。

2.4. Pull down和免疫共沉淀技术

Pull down技术主要在体外验证两种蛋白之间是否存在直接的相互作用。主要有两种常用的pull down方法:一种是用谷胱甘肽巯基转移酶(Glutathione s-Transferase, GST)标签(GST-tag)的亲和纯化柱进行的,称为GST-pull down;一种是用带组氨酸(Histidine, His)标签(His-tag)的亲和纯化柱进行的,称为His-pull down [21]。以GST-pull down为例,首先是获得带有GST标签的融合蛋白,然后将带有GST标签的融合蛋白亲和到谷胱甘肽层析柱上,接着将与融合蛋白发生相互作用的蛋白被亲和到谷胱甘肽层析柱上,最后切掉标签,洗脱得到相互作用的蛋白。

免疫共沉淀技术(Co-Immunoprecipitation, Co-IP)以抗体和抗原之间的专一性结合作用为基础,用于检测和确定生理条件下蛋白质之间的相互作用。其基本原理是将细胞在非变性条件下裂解,在细胞裂解液中加入特异性的抗体,这样抗体可以和已知的抗原形成抗原–抗体复合物,如果在系统中存在与已知抗原相互作用的蛋白质,该蛋白质也会以复合物的形式沉淀下来,经过洗脱就可以得到与已知抗原相互作用的蛋白质,然后进行SDS-PAGE及Western blotting分析 [22]。该技术研究的相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的处于天然状态的,因此可避免人为的影响,同时可分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。但Co-IP难以检测到弱或瞬时相互作用。此外,多个相互作用蛋白质复合物的存在也可引起Co-IP中的相互作用。

3. 靶基因与蛋白质互作

3.1. 酵母单杂交系统

酵母单杂交系统(Yeast one-hybrid system, Y1H)由酵母双杂交系统发展而来,是一种在酵母细胞内分析与鉴定转录因子和DNA顺式作用元件相互结合的有效方法 [12]。依据此原理构建目的基因与转录激活结构域融合的载体,将顺式作用元件和报告基因分别连在启动子的上游和下游,转录激活域融合蛋白与特异的DNA序列结合激活启动子下游报告基因表达。因此可以通过判断酵母克隆能否在与报告基因对应的营养缺陷型培养基上生长来证明目的蛋白能否与DNA序列结合。由于酵母单杂交系统常常受所用报告基因的影响,较高的假阳性一直是该技术的“瓶颈”问题。此外,在酵母单杂交系统中,假阴性一直被忽略。如某些外源基因的蛋白表达产物可能对酵母本身有毒性作用,影响酵母细胞的生长和表型,而这其中可能就包含着与靶DNA序列相互作用的蛋白。

3.2. 染色质免疫沉淀技术

染色质免疫沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation, ChIP)是一种利用抗原抗体反应的特异性,在染色质水平上真实反映体内基因组DNA与蛋白质结合情况的转录调控技术。其原理是在生理条件下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起,通过超声波将染色质随机切成小片段,利用抗原抗体的特异性识别反应,将与目的蛋白结合的DNA沉淀下来,检测目的片段得到蛋白质与DNA相互作用信息 [23]。Chip实验涉及众多的实验步骤,包括细胞固定、染色质断裂、染色质免疫沉淀、解交联、DNA的纯化以及DNA的鉴定,而且结果的重复性较低,因此对Chip实验过程的每一步都应设计相应的对照。

近年来发展起来的Chip-seq技术将染色质免疫沉淀技术(Chip)与芯片技术和第二代测序技术(seq)相结合,用来进行靶基因的高通量筛选,为研究目的蛋白与整个基因组相互作用提供了可能。

3.3. 凝胶电泳迁移技术

凝胶电泳迁移技术(Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA)又称为电泳迁移率改变分析技术和凝胶阻滞实验。这是一种利用探针体外分析DNA与蛋白质相互作用的凝胶电泳技术 [24]。其原理是蛋白质和DNA结合后增加了相对分子质量,在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中,DNA-蛋白质复合物与单一的DNA片段相比,前者迁移速度明显较慢。具体方法是将含有假定蛋白质结合位点的已标记DNA片段与纯化蛋白进行孵育,然后将反应产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。传统的32P标记探针的凝胶阻滞实验,具有很高的灵敏度,但会接触到危险性的放射性同位素且不容易定量分析。即使现在有很多研究报道利用非放射性标记的凝胶阻滞实验,但非放射性标记探针的凝胶阻滞试剂盒的费用很高。

3.4. 荧光素酶报告系统

荧光素酶报告系统(Luciferase reporter assay)指的是以荧光素为底物来检测荧光素酶活性的检测系统 [25]。荧光素酶是一种广泛使用的报告基因,其可以催化荧光素氧化成氧化荧光素,在荧光素氧化的过程中,会发出生物荧光(bioluminescence)。荧光素和荧光素酶这一发光系统具有极高的灵敏性。荧光素酶不仅可以作为一种报告基因进行检测分析,还可以用于化学污染物的监测与分析,此外还可以用于RNA干扰的研究、蛋白质之间作用的研究及微生物检测等,应用前景十分广阔 [26]。

4. 结论

转录调控在拟南芥、水稻等模式植物和作物中的研究越来越多。转录调控技术的应用有助于更好地阐明植物内部的转录调控机制。在这篇综述中,我们从蛋白质与蛋白质互作和靶基因与蛋白质互作这2个方面总结了植物转录因子主要分析方法,以期为植物转录因子的相关研究提供参考方法。

文章引用: 周蒋毅 , 周 倩 (2020) 植物转录因子研究方法。 植物学研究, 9, 25-30. doi: 10.12677/BR.2020.91003

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