钙敏感受体表达变化对实验性糖尿病大鼠心肌超微结构的影响
Effect of Calcium Sensitive Receptor Expression on Myocardial Ultrastructure in Experimental Diabetic Rats

作者: 白淑芝 , 姜哓姝 :哈尔滨医科大学病理生理学教研室,黑龙江 哈尔滨; 吴 昊 :黑龙江省森工总医院,黑龙江 哈尔滨; 吴 昱 :哈尔滨医科大学附属第二临床医院,黑龙江 哈尔滨;

关键词: 钙敏感受体糖尿病心肌Calcium-Sensing Receptor Diabetes Myocardium

摘要:
目的:观察钙敏感受体(CaSR)表达变化对实验性糖尿病大鼠心肌超微结构的影响。方法:Wistar大鼠随机分为对照组、糖尿病4周组和糖尿病8周组。通过高糖高脂饮食喂养联合腹腔注射STZ (30 mg/kg)建立糖尿病模型。通过透射电镜观察各组大鼠心肌超微结构的改变,心肌组织CaSR蛋白的表达通过Western blot检测。结果:与对照组相比,糖尿病组大鼠心肌CaSR蛋白表达随着病程的延长逐渐降低,心肌结构损伤严重。结论:在大鼠糖尿病心肌病发生发展过程中CaSR的表达逐渐下降,可能导致糖尿病心肌损伤、发生糖尿病心肌病的原因之一。

Abstract: Objective: To observe the effect of calcium sensitive receptor (CaSR) expression on myocardial ul-trastructure in experimental diabetic rats. Methods: Wistar rats were randomly divided into 3 groups including control, diabetic-4 week and diabetic-8 week groups. Rats in the diabetes group were fed a high-glucose and high-fat diet, and intraperitoneal injection of streptozotocin (STZ, 30 mg/kg) to establish a type 2 diabetes model. Cardiac morphological changes were observed by electron microscope, and CaSR protein expression in cardiac tissue was detected by Western blot. Results: Compared with the control group, diabetic groups showed decreased expression of CaSR protein in the myocardium of diabetic rats, and gradually worsened with the prolongation of the course of the disease. Conclusion: The CaSR expression of myocardium is reduced in the progression of diabetes, and it may lead to changes in myocardial ultrastructure.

1. 引言

我国糖尿病的发病率以达10%以上,其中近一半死于心血管合并症。糖尿病的严重合并症之一,即糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM) [1] ,发病机制十分复杂,迄今尚不明确。钙敏感受体(CaSR)属于G蛋白耦联受体超家族C家族成员之一,在国际研究已经成为热点内容,国内研究刚起步,主要集中对肾脏、胃肠道、神经系统等方面进行研究,在心血管系统研究的较少 [2] 。本实验主要检测DCM大鼠不同时段心肌组织CaSR蛋白的表达规律及心肌超微结构损伤的程度,为进一步揭示DCM的发生机制以及指导临床治疗奠定了一定的理论基础。

2. 材料与方法

2.1. 实验动物

健康雄性Wistar大鼠(210 g~250 g)购自哈尔滨医科大学附属二院动物研究所。

2.2. 主要试剂

佐链脲菌素(STZ, Biosharp, Japan),AA、TEMED、浓缩胶浓缩液、分离胶浓缩液、转移缓冲液、电泳缓冲液(北京普利莱);蛋白定量试剂盒(北京碧云天),GAPDH多克隆抗体(Santa Cruz, CA),CaSR抗体(Alpha Diagnostic International Inc., USA),其他试剂为国产分析纯。

2.3. 主要器材

BECKMAN低温离心机,透射电镜(H-7650, Japan),Western blot电泳槽(北京六一厂),紫外分光光度计(US-640),紫外凝胶检测和成像系统(Bio-Rad),酶标仪(DG3022 A),V -86 ℃ 超低温冰箱日本SANYO公司等。

2.4. 型糖尿病模型的制备

30只雄性大鼠,饲养在22℃~24℃的安静环境中。正常饲养一周后,动物随机分为3组,每组各10只。对照组大鼠给予正常的饮食、饮水。糖尿病4周组和8周组大鼠给喂养高糖高脂饮食(成分:2%胆固醇,1%胆酸钠,67%基础饲料,20%糖,10猪油%)。4周后,糖尿病组通过腹腔注射低剂量STZ (30 mg/kg) [3] 。三天后检测血糖高于16.7 mmol/L为造模成功。观察大鼠一般状态,每周监测血糖、饮食、饮水量,至实验完成。

2.5. 实验分组

1) 正常对照组(Con);2) 糖尿病4周组(D4w);3) 糖尿病8周组(D8w)。

2.6. 大鼠血糖水平测定

实验结束前一天,采用剪尾法,通过大鼠尾静脉采血用血糖仪(ACCU CHEK, Roche, Germany)检测血糖。

2.7. 电镜观察超微结构

取左心室心尖部组织,切成1 mm3大小组织多块,PBS洗涤1遍,2.5%戊二醛固定;PBS洗三次,4℃、1%锇酸固定,常规乙醇系列脱水,环氧树脂包埋,铅–铀双重染色,干燥后置于H-7650型透射电镜下,观察并摄片。

2.8. Western Blot检测蛋白的表达

将大鼠心室肌组织通过液氮研磨后加入组织裂解液,置于4℃条件下裂解1小时,每15分钟混匀一次。然后4℃,12,000 g离心15分钟,取上清进行蛋白质定量。取50 ug总蛋白样品进行10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,转印至PVDF膜,用5%封闭液室温封闭1小时后,分别用CaSR抗体(1:2000)、GAPDH(1:500)抗体4℃震荡过夜。再用二抗(1:1000的羊抗兔IgG二抗;1:1000的兔抗鼠IgG二抗,碱性磷酸酶标记)孵育,室温下振荡1小时。显色,在凝胶成像系统下拍照、分析。计算各蛋白条带的光密度值,蛋白表达水平以其与内参GAPDH光密度比值来表示。

2.9. 统计学处理

实验数据采用均数 ± 标准差( X ¯ ± S),采用方差分析和配对t检验判断其差异显著性。采用SPSS 17.0统计软件包进行统计学分析。

3. 结果

3.1. 大鼠一般体征

实验中观察了大鼠的一般状态,发现正常对照组大鼠精神良好,反应灵敏。糖尿病组大鼠都出现了饮水量增加,饮食增多,精神状态差,动作迟缓(表1)。

Table 1. General characteristics in control and diabetic rats

表1. 大鼠饮饮食饮水测定

P < 0.05 vs Control; P < 0.05 vs Dia-4w, n = 10.

3.2. 大鼠血糖测定

与正常对照组大鼠血糖相比,糖尿病4周组和8周组大鼠随机血糖显著升高(P < 0.05) (表2)。

Table 2. Random blood glucose measured in rats

表2. 大鼠血糖监测

P < 0.05 vs Control, n = 10.

3.3. 透射电镜下各组心肌组织超微结构的改变

电镜结果显示对照组心肌细胞排列规则,心肌细胞质膜完整,线粒体大小均一、排列整齐。糖尿病4周组和8周组出现心肌细胞排列杂乱,心肌细胞质膜不清晰、肌丝松散,部分发生断裂,线粒体大小不一,出现肿胀,甚至空泡样变,排列不规则,糖尿病8周组更为明显(图1)。

Control Dia-4w Dia-8w

Figure 1. The ultrastructure alteration of rat myocardium in different groups (×5000)

图1. 心肌超微结构的改变(×5000)

3.4. 心肌组织 CaSR蛋白表达的变化

通过Western blot检测CaSR蛋白的表达,与正常对照组相比,糖尿病4周组大鼠心肌组织CaSR表达降低,糖尿病8周组更低(P < 0.05) (表3)。

Table 3. Protein expression of CaSR in heart analyzed by Western blot

表3. 通过Western blot检测大鼠心肌CaSR蛋白表达

P < 0.05 vs Control; P < 0.05 vs Dia-4w, n = 6.

4. 讨论

本研究复制了糖尿病大鼠模型,监测了大鼠的一般状态、饮食、饮水及血糖,通过透射电镜观察心肌超微结构变化,并检测心肌组织CaSR蛋白的动态表达来探讨CaSR在大鼠DCM发生中的作用。

复制糖尿病的方法有多种,我们在实验中采用先用高糖高脂饮食诱导,然后进行腹腔注射STZ的方法来复制大鼠DCM动物模型。与对照组大鼠相比,糖尿病组大鼠出现多食、多饮,血糖一直处于高水平。上述结果,说明本实验成功建立了大鼠糖尿病动物模型。通过透射电镜观察发现与正常大鼠相比,糖尿病各组大鼠心肌出现了肌原纤维断裂、心肌细胞排列不规则,线粒体发生肿胀、空泡样变。心肌超微结构的损伤与文献报道的DCM的特点一致 [4] 。

DCM的发生机制迄今尚不明确。CaSR是G蛋白偶联受体,以前研究发现高脂血症和动脉粥样硬化能使心肌CaSR表达增加,心肌凋亡严重 [5] [6] ,这说明CaSR在心脏功能异常中发挥了至关重要的作用。但是,CaSR在DCM大鼠心肌的表达规律,迄今鲜见报道。我们检测了糖尿病大鼠心肌CaSR蛋白的表达情况,结果发现与正常对照组相比,糖尿病大鼠心肌CaSR蛋白的表达降低,尤其糖尿病8周组更低,心肌超微结构损伤也是糖尿病8周组更加严重。Ward等检测了1型糖尿病大鼠肾脏CaSR表达也是显著降低的 [7] 。

总之,我们的研究发现2型糖尿病大鼠心肌组织CaSR表达有一定的规律性,即随着病程延长逐渐降低,且心肌损伤逐渐加重,可能与CaSR表达减少造成细胞内钙稳态紊乱有关,在后续的研究中我们将进一步探讨。

基金项目

黑龙江省教育厅科技研究项目资助(12541276)。

NOTES

*通讯作者。

文章引用: 白淑芝 , 吴 昊 , 姜哓姝 , 吴 昱 (2019) 钙敏感受体表达变化对实验性糖尿病大鼠心肌超微结构的影响。 临床医学进展, 9, 116-120. doi: 10.12677/ACM.2019.92019

参考文献

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https://doi.org/10.3892/etm.2018.6755

[2] 徐长庆, 张伟华. 心血管系统钙敏感受体的研究进展[J]. 中国病理生理杂志, 2010, 26(2): 409-413.

[3] Zhang, M., Lv, X.Y., Li, J., et al. (2008) The Characterization of High-Fat Diet and Multiple Low-Dose Streptozotocin Induced Type 2 Diabetes Rat Model. Experimental Diabetes Research, 2008, Article ID: 704045.

[4] 林中民, 焦立卓, 郑怡, 等. 姜黄素衍生物B06对2型糖尿病大鼠心肌的保护作用及其机制探讨[J]. 中国应用生理学杂志, 2014, 30(1): 38-42.

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https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2006.09.142

[6] Zhang, W.H., Lu, F.H., Zhao, Y.J., et al. (2007) Post-Conditioning Protects rat Cardiomyocytes via PKC-Mediated Calcium-Sensing Receptors. Biochemical and Biophysical Research Communications, 361, 659-664.
https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2007.07.077

[7] Ward, B.K., Magno, A.L., Walsh, J.P., et al. (2012) The Role of the Calcium-Sensing Receptor in Human Disease. Clinical Biochemistry, 45, 943-953.
https://doi.org/10.1016/j.clinbiochem.2012.03.034

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