响应面实验优化小麦胚芽淀粉酶解工艺
Optimization of Enzymolysis Conditions for Treatment of Wheat Germ Starch Using Response Surface Methodology

作者: 叶云芳 , 刘 咏 , 汪苗苗 , 王军辉 :合肥工业大学食品与生物工程学院,安徽 合肥;

关键词: 小麦胚芽酶解响应面法工艺优化Wheat Germ Enzymolysis Response Surface Methodology Process Optimization

摘要:
在加酶量、料液比、酶解时间及酶解温度四个单因素试验的基础上,运用响应面分析法,以小麦胚芽中还原糖含量为评价指标,对α-淀粉酶酶解小麦胚芽中淀粉的最佳工艺进行了研究,并利用统计学方法建立了α-淀粉酶酶解小麦胚芽淀粉的二次多项数学模型。结果表明,最佳酶解条件为:酶添加量44 U/mL,酶解温度88℃,酶解时间70 min。在此条件下酶解产物的还原糖含量达(14.75 ± 0.36)%。该试验用响应面法优选出的酶解工艺合理可行,为小麦胚芽固体饮料的开发提供了理论依据。

Abstract: Based on the four single-factor experiments, namely enzyme dosage, solid-liquid ratio, tempera-ture and time, the optimization of enzymolysis conditions for treatment of wheat germ starch by α-amylase was studied using response surface methodology. A second-order mathematic model for the enzymolysis of wheat germ starch was established by statistical methods. The results showed that the optimal enzymolysis conditions were as follows: the enzyme dosage of 44 U/mL at 88˚C for 70 min. Under the optimal enzymolysis conditions, the reducing sugar content was obtained to (14.75 ± 0.36)%. The optimized enzymolysis conditions were proved reasonable and feasible, which can provide a theoretical basis for the development of wheat germ solid beverages.

1. 引言

小麦胚芽又称麦芽粉、胚芽,金黄色颗粒状,是小麦发芽和生长的器官,约占小麦籽粒重量的2%~3% [1] 。小麦胚芽富含高品质蛋白质和脂肪酸、维他命E、B1和膳食纤维以及生理活性物质如黄酮类化合物和甾醇,营养价值非常的高 [2] 。但是由于小麦胚芽高灰分和色泽的影响,若将其混入面粉中,会影响面粉的色泽,也不利于面粉的长期贮藏。因此在小麦制粉过程中胚芽往往被脱除,作为下脚料扔掉或用作饲料 [3] 。

目前国内外对小麦胚芽的综合开发利用有很多,包括麦胚面制品、麦胚豆制品以及小麦胚芽油等 [4] 。葛焕生 [5] 等通过优化小麦胚芽饮料加工工艺,研制出一种利于人体生理健康的天然饮料,提高了小麦胚芽的综合利用率。但是,由于小麦胚芽中含有的淀粉在经过加热后易糊化,糊化后的淀粉容易老化产生沉淀或分层,造成制成的饮料溶解性差 [6] [7] 。用α-淀粉酶处理小麦胚芽中的淀粉,使其生成小分子糊精和还原糖 [8] ,制成后的饮料溶解性比较理想。而且降低了物料的黏度,有利于小麦胚芽固体饮料制作后期喷雾干燥制粉的工艺过程。

本实验以超微粉碎的小麦胚芽粉为原料,采用α-淀粉酶进行小麦胚芽淀粉的酶解,在单因素实验的基础上,运用响应面法优化酶解条件。旨在解决淀粉引起的饮料溶解性问题,为实现规模化生产营养健康的小麦胚芽饮料提供一定的理论基础。

2. 材料与方法

2.1. 材料与试剂

新鲜小麦胚芽购自河南省驻马店汝南县,将小麦胚芽放置在温度为−20℃的冰箱内,保存备用。

α-淀粉酶:国药集团化学试剂有限公司。其他试剂均为分析纯。

2.2. 试验方法

2.2.1. 小麦胚芽粉的制备

将小麦胚芽放入干燥箱中烘干,使用超微粉碎机将干燥的小麦胚芽粉碎15 min,过100目筛,得到小麦胚芽粉。

2.2.2. 单因素实验

将α-淀粉酶加入到小麦胚芽粉溶液中,进行酶解条件的单因素实验。α-淀粉酶加入量为10~50 U/mL,料液比为1:8~1:16,酶解时间为30~90 min,酶解温度为80℃~100℃,逐个考察不同单因素酶解条件对还原糖含量的影响。

2.2.3. 响应面优化实验设计

根据单因素试验结果,以α-淀粉酶的添加量、酶解时间和酶解温度为影响因素,酶解后的产物还原糖含量为响应值,采用Design-Expert. V8.0.6软件进行响应面优化实验。

2.2.4. 测定指标与方法

还原糖含量的测定采用 DNS比色法 [9] 。

2.3. 数据处理与统计分析

采用Excel 2010和 应用统计分析软件Origin 9.0对实验数据进行整理和分析,同时采用Design-Expert. V8.0.6统计软件进行响应面优化分析。

3. 结果与讨论

3.1. 单因素实验结果

3.1.1. 酶添加量对还原糖含量的影响

在料液比1:12,酶解温度为90℃的小麦胚芽粉溶液中,分别按酶添加量为10、20、30、40、50 U/mL加入α-淀粉酶水解60 min。冷却至室温,取离心后的上清液测定还原糖含量,结果见图1。当酶添加量较低时,小麦胚芽酶解液中还原糖含量呈现显著增大的趋势。这可能是因为在酶解反应的初期,反应速率与酶含量成正比。增加酶含量,底物与酶充分接触、结合,淀粉颗粒迅速被降解成小分子的糖类,因此酶解液中还原糖含量不断增加。当继续增加酶浓度时,底物与酶分子的结合程度达到饱和,没有更多的接触位点与底物结合反应,还原糖含量趋于平缓。因此,α-淀粉酶酶添加量最适宜单因素浓度为40 U/mL,可得还原糖含量为(6.40 ± 0.009)%。

Figure 1. Effect of enzyme dosage on reducing sugar content

图1. 加酶量对还原糖含量的影响

3.1.2. 料液比对还原糖含量的影响

在加酶量为40 U/mL,酶解温度为90℃,酶解时间60 min的条件下,研究料液比1:8、1:10、1:12、1:14、1:16对酶解反应还原糖含量的影响。冷却至室温,取离心后的上清液测定还原糖含量,结果如图2所示。随着溶剂用量的增加,还原糖含量逐渐增大,当料液比在1:10时,还原糖含量达到最大值。随后再增大溶剂用量,还原糖含量随之降低。这可能是由于较大的料液比将淀粉酶和底物浓度稀释,酶解效果反而下降。因此,最适宜的料液比为1:10,还原糖含量为(9.48 ± 0.013)%。

Figure 2. Effect of solid-liquid ratio on reducing sugar content

图2. 料液比对还原糖含量的影响

3.1.3. 酶解时间对还原糖含量的影响

选取最适宜料液比1:10、加酶量为40 U/mL的小麦胚芽液,酶解温度90℃,考察酶解时间分别为30、45、60、75、90 min对酶解反应还原糖含量的影响。冷却至室温,取离心后的上清液测定还原糖含量,结果见图3。随着酶解时间的延长,还原糖含量先逐渐增大,超过60 min后还原糖含量随时间延长而逐渐降低,在60 min时出现最大值。酶解时间增加还原糖含量反而降低,可能是由于底物浓度的降低和产物的增加对反应的抑制作用。所以,最适酶解时间为60 min,还原糖含量为(11.62 ± 0.002)%。

Figure 3. Effect of enzymatic time on reducing sugar content

图3. 酶解时间对还原糖含量的影响

3.1.4. 酶解温度对还原糖含量的影响

选取最适料液比1:10、加酶量为40 U/mL的小麦胚芽液以最适酶解时间60 min,在80℃-100℃的温度梯度下分别进行酶解反应。冷却至室温,取离心后的上清液测定还原糖含量,结果见图4。在80℃~90℃范围内,还原糖含量随着温度的上升而增加,这可能是由于淀粉在加热条件下吸水膨胀,更容易与淀粉酶接触反应。继续增加酶解温度,还原糖含量降低,这可能是因为高温下部分α-淀粉酶失活,酶解反应下降。所以,最适酶解温度为90℃,其还原糖含量为(13.75 ± 0.003)%。

Figure 4. Effect of enzymatic temperature on reducing sugar content

图4. 酶解温度对还原糖含量的影响

3.2. 响应面法优化酶解条件

3.2.1. 响应面法优化实验设计

以α-淀粉酶加酶量、酶解时间及酶解温度为影响因素,酶解产物还原糖含量为响应值,采用Design-Expert. V8.0.6软件进行设计与分析,通过响应面法优化酶解工艺,实验因素水平设计见表1

Table 1. Factors and levels used in Box-Behnken experimental design

表1. Box-Behnken试验设计因素及水平

3.2.2. 响应面法的实验设计与结果

根据Box-Behnken试验设计原理,结合单因素实验结果,酶解工艺响应面优化的数据结果如表2所示。

Table 2. BBD and results for amylase hydrolysis

表2. 酶解反应响应面优化设计与试验结果

根据表2结果,利用Design-Expert. V8.0.6软件建立小麦胚芽粉酶解液还原糖含量(Y)对酶添加量(A)、酶解温度(B)、酶解时间(C)的二次多项回归模型:Y = 13.964 + 0.79625A + 0.1925B + 1.39125C − 0.4025AB + 0.055 AC − 0.2225BC − 0.7645A2 − 0.587B2 − 0.6095C2

还原糖含量(%)在回归方程中,A、B、C变量的正系数表明该变量的正向变化能引起响应值的增加,负的二次项的系数表明方程的抛物面开口向下,具有极大值点,能够进行最优分析 [10] 。

3.2.3. 模型的建立与显著性检验

利用Design-Expert. V8.0.6软件对各试验条件下的数据结果(表2)进行二次多元回归拟合,得到了方差分析结果,如表3所示。

Table 3. ANOVA for the fitted quadratic polynomial model on amylase hydrolysis

表3. 酶解反应响应面模型的方差分析

注:**.P < 0.01,差异极显著;*.P < 0.05,差异显著。

利用Design-Expert. V8.0.6软件进行二次多元回归拟合,由软件失拟项测试推荐的二次模型拟合实验数据,采用二次模型进行变异分析。回归方程中各变量对响应值(还原糖含量)影响的显著性由F检验来判定,概率P的值越小,则相应变量的显著程度越高 [11] 。由表3方差分析结果可知,总回归方程模型F检验p值 < 0.0001,达到极显著的水平。决定系数R2 = 0.97,纯误差 = 0.06,说明该模型与实际值拟合良好。并且回归方程的失拟项 = 0.1756 (>0.05),失拟性不显著,说明未知因素对实验结果干扰很小,可以用于优化小麦胚芽淀粉酶解实验的理论预测。A (p = 0.0002)、C(p < 0.0001)这2个因素对试验模型是极显著的。这3个因素对酶解反应还原糖含量影响大小排序依次是C > A > B,即酶解时间 > 酶添加量 > 酶解温度。

3.2.4. 各因素交互作用对还原糖含量的响应面分析

通过观察图5中响应面的变化情况和等高线的稀疏程度可直观地反映酶添加量(A)、酶解温度(B)、酶解时间(C)之间的交互作用对小麦胚芽淀粉酶解后的还原糖含量的影响,当等高线呈椭圆形或马鞍形时表示两因素交互作用显著,而呈圆形则表示两因素交互作用不显著 [12] 。

(A) (a) (B) (b) (C) (c)

Figure 5. 3D-response surface plots (A), (B), (C) and contour plots (a), (b), (c) for amylase hydrolysis (a) Enzyme dosage and temperature; (b) Enzyme dosage and time; (c) Temperature and time

图5. 酶解反应三维响应面(A)、(B)、(C)和二维等高线图(a)、(b)、(c),(a) 酶添加量与酶解温度;(b) 酶添加量与酶解时间;(c) 酶解温度与酶解时间

图5(a)可知,酶添加量的变化曲面比酶解温度的变化曲面陡峭,说明酶解温度比酶解时间的影响更显著一些,与方差分析结果相符。由图5(b)可知,酶解时间的变化曲面和酶添加量的变化曲面均较陡峭,说明酶解时间和酶添加量对还原糖含量的影响均较显著,与方差分析结果相符。由图5(c)可知,酶解时间的变化曲面较陡峭,相比之下,酶解温度的变化曲面平缓一些,说明酶解时间较酶解温度对还原糖含量的影响显著,与方差分析结果相符。

3.2.5. 最佳条件的确定和回归模型的验证

响应面曲线及其等高线分析,模型方程优化求解表明,小麦胚芽酶解最佳工艺条件为酶添加量为44.05 U/mL,酶解温度为88.35℃,酶解时间为69.80 min,在此条件下得到的还原糖含量为14.98%。实际操作中稍作调整确定的最佳工艺条件为酶添加量44 U/mL,酶解温度88℃,酶解时间70 min,在此条件下进行验证实验,得到的还原糖含量为(14.75 ± 0.36)%,与模型的预测值基本相符。

4. 结论

本研究在单因素实验的基础上,通过响应面软件优化α-淀粉酶对小麦胚芽酶解反应后,获得的小麦胚芽最优酶解条件为酶添加量44 U/mL、酶解温度88℃和酶解时间70 min,得到的还原糖含量为(14.75 ± 0.36)%。获得还原糖含量与酶解条件各因素变量的二次方程模型,该模型回归显著,对试验拟合程度好,表明小麦胚芽淀粉酶解条件的优化准确可靠。

NOTES

*通讯作者。

文章引用: 叶云芳 , 刘 咏 , 汪苗苗 , 王军辉 (2018) 响应面实验优化小麦胚芽淀粉酶解工艺。 食品与营养科学, 7, 265-273. doi: 10.12677/HJFNS.2018.74032

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