AGCU Database Y30试剂盒技术指标评价及法医学应用
Evaluation and Forensic Applications of AGCU Database Y30 Kit

作者: 施元亮 :无锡市公安局惠山分局,江苏 无锡; 汤 晓 :常熟市公安局,江苏 苏州; 章 俊 , 王靖元 , 李倩倩 :无锡中德美联生物技术有限公司,江苏 无锡;

关键词: Y-STR法医遗传学复合PCR六色荧光标记AGCU Database Y30Y-STR Forensic Genetics Multiplex PCR 6-Dye Fluorescence-Labelling AGCU Database Y30

摘要:
测试AGCU Database Y30试剂盒的六色荧光标记复合PCR检测体系,评估其技术指标及在法医学的应用价值。采集300份无关男性样本,对AGCU Database Y30试剂盒性能(灵敏度、稳定性、准确性、种属特异性,对男女混合样本、常见普通检材样本及建库样本的扩增能力)进行测试。该试剂盒检测样本准确,且灵敏度较高,最小检出量为0.125 ng;同一来源不同载体样本具有同一性、种属特异性高、抗抑制性效果良好,女性DNA或其他男性DNA存在下(19:1)仍然分型准确,且在不同批次试剂间结果稳定,对于血液痕迹、唾液、骨骼等不同常见检材样本的检测结果具有一致性,不同PCR环境均可获得完整分型。AGCU Database Y30试剂盒可应用于法庭科学实际检案与建库实验。

Abstract: The 6-dye fluorescence-labelling multiplex PCR detection system of the AGCU Database Y30 kit was tested to evaluate its technical specifications and its application value in forensic pathology. 300 unrelated male samples were collected to validate the performance of the AGCU Database Y30 kit (sensitivity, stability, accuracy, species specificity, and the amplification capabilities of male and female mixed samples, common samples, and building database samples). The kit is accurate with high sensitivity in detecting samples, and the minimum detectable amount is 0.125 ng. Different carrier samples from the same source have the same identity, high species specificity, and good anti-inhibitory effect. It has high sensitivity in the presence of female DNA or other male DNA (19:1). Stable results can be acquired between different batches of reagents. It has consistency for common blood samples, saliva, bones, and other common samples, and it got complete typing in different PCR environments. The AGCU Database Y30 kit can be applied to forensic science inspections and database-building experiments.

1. 引言

司法鉴定及案件排查中,Y染色体的STR检验已成为常规手段。Y染色体是呈父系遗传、单倍型及连锁遗传的染色体,为男性特有,在亲权鉴定及家系案件排查中发挥重要作用 [1] [2] [3] [4] 。目前,主流的Y-STR商品化检测试剂盒很多,如Yfiler (ABI)、Yfiler Plus (ABI)、DNATyper Y21 (公安部二所)、Powerplex Y23 (Promega)、AGCU Y24 (中德美联)等,但它们检测的基因座数目在17~27个之间,有的试剂盒引入了3~7个快速突变的基因座位点。而Y-STR快速突变的基因座的突变率过高,达到1 × 102以上,虽然在某种程度上提升了Y-STR的个体识别能力(Discrimination power, DP) [5] ,但是并不适合家系搜索,不利于刑侦案件的排查。而AGCU Database Y30试剂盒是由30个突变率低的Y-STR基因座位点组成的6色荧光复合扩增体系,低突变基因座组成的单倍型具有更好的家族谱系代表性,更加有利于Y-STR DNA数据库建设、案件侦破、法庭证据及亲权鉴定,降低了同系异型的风险 [6] [7] 。

本文根据SWGDAM和GA/T815-2009的具体要求,对AGCU Database Y30试剂盒的准确性、一致性、灵敏度、特异性、抗抑制性、同一性和混合样本进行检测评价。

2. 材料与方法

2.1. 样本

随机抽取本实验室日常案件的无关男性血液样本300份,无关女性血样20份,包括各类常见检材若干份,如血液痕迹、骨骼、唾液斑等DNA提取样本。购自农贸市场的猪、牛、羊、鸡、鸭、鱼、鼠、兔血用于种属特异性检测。

2.2. 主要试剂与仪器

扩增试剂:AGCU Database Y30试剂盒;扩增仪:9700型PCR仪(美国ABI公司);遗传分析仪:3130xl遗传分析仪(美国ABI公司);DNA标准品:9948及007(男性DNA),9947A(女性DNA);血红素、靛蓝、腐植酸、钙离子、血红蛋白和EDTA等抑制剂均使用sdH2O进行稀释。

2.3. 测试方法

2.3.1. 准确性与一致性测试

Control DNA 9948准确性测试:选取Database Y30试剂盒内的Control DNA 9948,根据试剂盒的说明要求,配制25 µL和10 µL扩增体系,进行三次平行检测,与说明书上的阳性分型进行比较。

样本一致性测试:选取20份无关男性样本,根据试剂盒的说明要求,用Database Y30进行检测;同样的20份无关男性样本,用AB公司的Y filer或Y filer plus试剂盒进行重复位点验证(10 µL扩增体系)。

2.3.2. 灵敏度测试

取Control DNA 9948和Control 007标准品,用超纯水分别稀释至1.0 ng/µL、0.5 ng/µL、0.25 ng/µL、0.125 ng/µL、0.1 ng/µL、0.05 ng/µL,扩增体系为25 µL,每个浓度重复扩增三次,统计两种标准品各个基因座的检出情况。

2.3.3. 同一性测试

选取同一来源不同载体上的样本,如FTA血卡、FTA唾液卡、汗斑、毛发、肌肉组织、肋软骨等样本;根据试剂盒的说明要求,配制10 µL扩增体系,进行扩增、电泳检测,分析其等位基因检出情况。

2.3.4. 稳定性测试

AGCU Database Y30试剂盒扩增前组份反复冻融5次和10次,对照组一直存放在−20˚C,根据试剂盒的说明要求,配制25 µL扩增体系,进行扩增、电泳检测,分析不同条件下,其分型结果有无明显差异。

2.3.5. 抗抑制测试

向标准品1 ng Control DNA 9948中加入选取的血红素、靛蓝、腐植酸、钙离子、血红蛋白和EDTA等抑制剂,制备模板(表1)。根据试剂盒的说明要求,配制25 µL扩增体系,分析其等位基因检出情况。

2.3.6. 特异性测试

种属特异性测试:选取猪、狗、牛、猫、鸡、鸭、鼠、兔、鱼和大肠杆菌DNA,按照Database Y30试剂盒说明书,配制10 µL扩增体系,进行扩增、电泳检测,分析其有无出峰情况。

Table 1. Concentration of inhibitor in template

表1. 模板中抑制物浓度

性别特异性测试:选取20例女性无关个体血样,用本实验室常用的提取试剂盒提取DNA;按照Database Y30试剂盒说明书,配制10 µL扩增体系,进行扩增、电泳检测,分析其有无出峰情况。

2.3.7. 混合样本测试

男/男混合样品测试:取Control DNA 9948与Control 007标准品,在两者浓度比1:1、1:4、1:9、1:19、1:29的比例混合,进行PCR扩增和DNA分型检测,每种混合比例进行三次平行试验。

男/女混合样品测试:取Control DNA 9948 (男性DNA)与Control 9947A (女性DNA)标准品,在两者浓度比1:1、1:4、1:9、1:19、1:29的比例混合,进行PCR扩增和DNA分型检测,每种混合比例进行三次平行试验。

2.3.8. PCR环境测试

分别采用10 μL、25 μL扩增体系,采用l×、2×引物量,对l ng Control DNA 9948标准品分别进行检验并重复3次;设置退火温度为56˚C、57˚C、58˚C、59˚C、60˚C、61˚C、62˚C、63˚C;热循环次数为29、30次,对同一样品分别进行检验并重复3次。

3. 测试结果

3.1. 准确性与一致性

以Control DNA 9948、滤纸、FTA卡为扩增模板,进行反复多次扩增,更换实验仪器,与对照比较,扩增效率无明显差异,分型结果稳定、图谱完整清晰,未见明显非特异性峰。与AmpFISTR®Yfiler plus®试剂盒在共有基因座上分型结果完全相同(图1),说明该试剂盒具有良好的准确性与一致性。

3.2. 灵敏度

将6种浓度的标准品9948和007分别检测,检验结果发现,当模板含量低至0.125 ng时,所有基因座的等位基因均能被检测到,如图2所示;而当模板含量降至0.10 ng时,D12S391、DYS635、DYS389II、DYS390、Y_GATA_H4和DYS392等六个基因座的等位基因峰高过低;进一步降低模板含量至0.05 ng时,AGCU Database Y30系统80%的等位基因未被检出。所以本试剂盒可有效检测样本的灵敏度为0.125 ng。

3.3. 同一性

实验结果发现,同一来源的血斑、唾液斑、汗液、毛发等样本DNA分型结果均具有同一性(图3),表明该试剂盒能够准确判断基因型。对不同的样本种类,如FTA卡(博坤)、FTA卡(国产)唾液卡、提取样本、Control DNA 9948均适用。

3.4. 稳定性

试剂盒成分稳定性测试发现,如图4所示,将试剂盒组分反复冻融10次,在第10次时进行PCR扩增及电泳检测,分析结果发现,不同载体样本(FTA卡与滤纸)与对照阳性比较,扩增效率无明显差异。

3.5. 抗抑制剂测试

通过抗抑制剂测试发现,当标准品加入浓度为50 μmol/L和75 μmol/L的血红素,仍可获得完整分型;血红素浓度大于75 μmol/L时,则只能获得部分基因座分型,且随着浓度增加,获得的基因座逐渐减少。相比其他试剂盒,本试剂对血红素具有较高的耐受性。扩增体系可耐受的抑制剂浓度见表2

Figure 1. The results of accuracy test (a): AGCU Database Y30 kit; (b): Yfiler Plus kit

图1. 准确性测试结果(a):AGCU Database Y30试剂盒;(b):Yfiler Plus试剂盒

Figure 2. The results of sensitivity test (0.125 ng 9948)

图2. 灵敏度测试结果(0.125 ng 9948)

Figure 3. The results of consistency test

图3. 同一性测试结果

Figure 4. DNA profile of freeze-thaw 10 times

图4. 冻融10次的分型图谱

Table 2. Inhibitor concentrations tolerance of AGCU Y30 kit

表2. 扩增试剂可耐受抑制剂浓度

3.6. 特异性

对本研究选择的样本如猪、牛、狗、猫、鸡、鸭、兔、鱼、鼠和大肠杆菌DNA进行检验,在分型范围内,除阳性对照,不出现特异的DNA分型。说明该试剂盒具有种属特异性。检测20例女性无关个体血样,结果发现无出峰情况(图5)。说明该试剂盒具有良好的性别特异性。

3.7. 混合样本检测效果

混合样本实验结果显示当模板总量为1.25 ng,Control DNA 9948与Control DNA 9947A及Control DNA 007的混合比例均为1:19时,能够准确检出ControlDNA 9948的每个基因座的基因分型。实验结果

(a) (b) (c)

Figure 5. The test result of specificity

图5. 特异性测试结果

图6图7所示。

3.8. PCR环境测试结果

扩增体系与引物量:不同体系扩增检测结果如图8所示,25 μL和10 μL扩增体系检测中,等位基因分型一致,未出现等位基因丢失及非特异性峰,峰高无明显差异。分别用1×、2×引物量进行扩增时,分型结果一致,未出现等位基因丢失及非特异性峰。

退火温度与循环次数:由结果可知,无论是以FTA卡还是滤纸为载体,59˚C退火温度下,扩增29个循环分型结果一致(如图9图10)。63˚C时,等位基因分型出现不均衡现象,部分等位基因峰值低于100。

4. 讨论

综上对AGCU Database Y30试剂盒进行的技术指标及性能评价,结果证明,该试剂盒能够准确分型,且检出成功率高,在男女混合样本中(女:男 = 19:1)仍然能够准确检测分型,同时具有较好的种属特异性。并且该试剂盒符合DNA检测试剂的标准,可适用于不同检材。此外,由于采用直接扩增,可省去DNA提取部分,缩短操作时间,简化操作流程,并降低样品污染几率。

我们的法庭科学DNA数据库自建立以来,已在公安实际检案中发挥了重要作用。由于各类犯罪案件中,男性居多,在DNA数据库中增加男性家系的Y染色体的遗传特性及比对功能,将会进一步拓展DNA数据库的功能。Yfiler、Yfiler Plus、Powerplex Y23等试剂盒主要以欧美人为主进行基因座选择,而且加

Figure 6. The test result of male/female mixture (9948: 9947A = 1:19)

图6. 男/女混合样本测试结果(9948: 9947A = 1:19)

Figure 7. The test result of male/male mixture (9948:007 = 1:19)

图7. 男/男混合样本测试结果(9948:007 = 1:19)

Figure 8. The test result of amplification system 25 μL and 10 μL

图8. 25 μL和10 μL扩增体系测试结果

入了3~7个快速突变的基因座位点 [8] 。快速突变的基因座在某种程度上提高了个体识别能力,以及同一父系遗传男性个体间的区分能力 [5] ,但是削弱了Y染色体遗传的应用价值。

本研究采用毛细管电泳的方式检测Y-STR位点,检测位点多,且简便易行;而新一代测序检测方式还未普及,测序繁琐且昂贵。AGCU Database Y30试剂盒采用六色荧光检测技术,实现了30个Y-STR基因座在同一管内的复合扩增、检测。筛选了中国人群的低突变率的基因座,其单倍型具有更好的家族谱系代表性,更加有利于中国人群的Y-STR DNA数据库建设及案件侦破 [9] 。Database Y30试剂盒中,各基因座的分布及荧光标记类型见表3。分型标准物(Allelic Ladder)包括了中国人群Y-STR中常见的等位基因,检测结果见图11。由图11可见,各位点分型清晰,且峰高均衡。综上,本文测试结果证明,AGCU

Figure 9. DNA profile of FTA card in 59˚C

图9. FTA卡在59˚C退火温度下的分型

Figure 10. DNA profile of FTA card in 63˚C

图10. FTA卡在63˚C退火温度下的分型图谱

Figure 11. Detection map of allelic ladder using Database Y30 kit

图11. Database Y30试剂盒中分型标准物(Allelic Ladder)检测结果

Table 3. The loci distribution of Database Y30 kit

表3. Database Y30试剂盒中基因座分布

Database Y30试剂盒在Y染色体数据库建设及实际案件排查中具有良好的应用前景。

文章引用: 施元亮 , 汤 晓 , 章 俊 , 王靖元 , 李倩倩 (2018) AGCU Database Y30试剂盒技术指标评价及法医学应用。 自然科学, 6, 216-229. doi: 10.12677/OJNS.2018.63032

参考文献

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