基于Box-Behnken设计–响应曲面法优化丹皮酚的提取工艺
Optimization of Extract Process of Paeonol by Response Surface Method Based on Box-Behnken Design

作者: 杨 桐 :重庆市璧山来凤中学校,重庆;

关键词: 响应曲面法丹皮酚优化提取工艺Response Surface Paeonol Optimization Extract Process

摘要:
目的:基于Box-Behnken设计–响应曲面法优化丹皮酚的提取工艺。方法:根据单因素实验数据,选择乙醇浓度(体积分数)、提取温度和提取时间,进行三因素三水平的Box-Behnken中心组合试验设计,采用响应曲面法(RSM)分析三个因素对响应值的影响。结果:最佳提取工艺条件为乙醇浓度77.5%,提取温度50℃,提取时间2 h,料液比30:1 (mL/g)时,提取率为92.3%;结论:该丹皮酚提取工艺稳定可靠,能应用于工业化生产。

Abstract: Objective: To optimize the extract process of paeonol from the roots of Paeonia suffruticosa Andrews adopted by response surface method basing on Box-Behnken design. Method: According to the results of the single factor experiment, a three-factor and three-level Box-Behnken central composite design coupled with response surface analysis (RSM) was employed to evaluate the influence of ethanol concentration, extract temperature and time on extract yield of paeonol. Result: The best extract condition was that 77.5% ethanol (V/V) extracted the crude powder of the root of Paeonia suffruticosa Andrewsat 50˚C for 2 h, solid/liquid ratio 30:1 (mL/g), 92.3% extract yield was obtained. Conclusion: The extract process of paeonolis stable and available for further industrial application.

1. 引言

牡丹(Paeonia suffruticosa Andrews)是毛茛科植物,其干燥根皮俗称牡丹皮,别名丹皮、粉丹皮、木芍药、条丹皮等,丹皮是一种传统中药,首载于《神农本草经》:主寒热,中风瘛疭、痉、惊痫邪气,除症坚瘀血留舍肠胃,安五脏,疗痈疮。丹皮酚(Paeonol)又称牡丹酚、芍药醇,系牡丹皮挥发油的主要成分。现代药理学研究表明,丹皮酚具有消炎 [1] 、抗乙型肝炎 [2] 、抗心肌损伤 [3] 、抗氧化 [4] 、抗螨虫 [5] 和降血糖 [6] 等作用。随着对丹皮酚药理研究范围的不断拓展,其提取和分离的工艺研究也在不断深入。

目前丹皮酚的提取方法有CO2超临界萃取法 [7] 、超声法 [8] 、微波法 [9] 、水蒸气蒸馏法 [10] 和乙醇渗漉法 [11] 等。对于CO2超临界萃取法、超声法和微波法,工业生产中提取设备费用昂贵;水蒸气蒸馏法容易产生大量工业废水;乙醇渗漉法提取速率慢,提取时间长。因此,采用溶剂提取时,如果能优化工艺,回收溶剂,减少废液排放,在提取工艺简单化同时,使生产成本大大降低,将更加符合实际生产需求。响应曲面法(Response surface methodology, RSM)将有助于对提取工艺进行优化。它是一种集数学、统计学于一体的试验设计方法,通过描绘评价指标(或响应值)对试验变量的响应面,采用多元二次方程来拟合变量和响应值之间的函数关系,最终找到试验变量的最佳组合及最优响应值 [12] [13] 。与往常用的均匀设计和正交设计相比,弥补了实验精度不够,建立的数学模型预测性较差的缺点,在中药有效成分提取中发挥着越来越重要的作用。

本研究拟采用乙醇溶剂法提取丹皮酚,先设计单因素实验,再采用Box-Behnken响应曲面法考察乙醇浓度(体积分数)、提取温度和提取时间三个因素对提取率的影响,从而优化丹皮酚的提取工艺,为实际生产提供参考数据与依据。

2. 材料

2.1. 材料

丹皮购自重庆市垫江县澄溪镇丹皮种植区,将丹皮烘干和粉碎待用。

2.2. 仪器

岛津LC-20AD高效液相色谱仪(日本岛津仪器公司);UV-3150型紫外可见分光光度计(日本Jasco公司);AL-104电子分析天平(美国梅特勒-托利多仪器有限公司);德国Heidolph MR Hei-Tec磁力搅拌器(香港德祥科技有限公司);RE-52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);FFC-45D型粉碎机(临沂大华机械厂);DHG-9075A型电热恒温鼓风干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司)。

2.3. 药品及试剂

丹皮酚(西南大学药学院药用资源化学研究所自制,HPLC纯度 > 99.0%);甲醇(色谱纯,成都市宜邦科析仪器有限公司);磷酸,95%乙醇(皆分析纯,成都市科龙化工试剂厂);纯水器(重庆前沿水处理设备有限公司)。

3. 方法

3.1. 丹皮酚含量的测定

3.1.1. HPLC条件 [14]

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,流动相甲醇−0.1%磷酸水溶液(45:55, V/V);流速0.5 mL·min−1;紫外检测波长274 nm;进样量10 μL。

3.1.2. 丹皮酚的提取率

按照2015版《中国药典》,牡丹皮药材含量测定项下操作,平行测3次。丹皮酚提取率(%) = 丹皮酚提取量(g)/药材中丹皮酚总量(g) × 100%。

3.2. 原料预处理

将丹皮在50℃恒温鼓风干燥箱内烘干,粉碎过60目筛后备用。丹皮颗粒大,丹皮酚的提取溶出度小;颗粒小,原料过滤分离慢,颗粒直径控制在1 mm左右。

3.3. 丹皮酚的提取与测定

称取丹皮样品50 g,置于配回流装置的圆底烧瓶中,加入不同浓度(体积分数)的乙醇溶液250 ml,在不同温度下磁力搅拌(1500 rpm)一定的时间,过滤后滤液定容,根据药典中的高效液相色谱法,以纯化的丹皮酚标准品作标准曲线,测定丹皮酚的提取率。实验先采用单因素实验考察料液比、乙醇浓度、提取温度和时间对丹皮酚提取率的影响。四组单因素实验具体方案如下:① 料液比10:1、20:1、30:1和40:1 (mL/g) (固定条件:乙醇浓度80%、提取温度50℃、提取时间2 h);② 乙醇浓度20%、40%、60%、80%和95% (固定条件:料液比20:1 (mL/g)、提取温度50℃、提取时间2 h);③ 提取温度15℃、30℃、50℃、70℃和90℃ (固定条件:料液比20:1 (mL/g)、乙醇浓度80%、提取时间2 h);④ 提取时间0.5 h、1 h、2 h、3 h和4 h (固定条件:料液比20:1 (mL/g)、乙醇浓度80%、提取温度50℃)。每组实验重复3次。

3.4. 数据分析方法

根据单因素实验结果,选取乙醇浓度、提取温度和时间对丹皮酚提取率影响较大的因素,通过响应曲面法,利用Box-Behnken软件对提取条件进行回归设计和优化,每一变量的低、中、高水平分别为−1,0,1进行编码,实验因素和水平见编码见表1

4. 结果与分析

4.1. 单因素实验

4.1.1. 料液比对丹皮酚提取率的影响

图1可知,牡丹中丹皮酚的提取率随着料液比的增加先增大后趋稳定,当料液比大于30:1时,提取率略有降低。这可能与固液两相的扩散和吸附平衡有关,起初以扩散为主,溶质浓度增大,提取率增

Table 1. Protocol of Box-Behnken central composite design

表1. Box-Behnken中心组合实验设计方案

Figure1. Effect of solid/liquid ratio on paeonol extract yield

图1. 料液比对丹皮酚提取率的影响

加;然后随着溶剂增多,固相吸附能力增加,溶质在溶剂中的分配减少,提取率出现降低。

4.1.2. 乙醇浓度对丹皮酚提取率的影响

图2得到,随着乙醇浓度的增加,丹皮酚的提取率先增加后降低。乙醇浓度增加,丹皮酚的溶解度增加,当达到80%时,丹皮酚提取率达到最高90%;当继续增加乙醇浓度时,其他脂溶性成分溶解度也开始增加,有可能影响了丹皮酚的提取效果。

4.1.3. 提取温度对丹皮酚提取率的影响

图3观察发现,随着提取温度的增加,丹皮酚的提取率增加,但当温度70℃~90℃,乙醇的挥发速度加快,溶剂有损失。在低于50℃时,提取率增加明显;当温度高于50℃时,提取率的增加明显减缓。

4.1.4. 提取时间对丹皮酚提取率的影响

图4观察可知,提取2 h时提取率最高,随着提取时间的延长,提取效果趋于稳定。这可能与溶质在溶剂中的饱和度有关,当溶质逐渐达到最大溶解时,丹皮酚提取率变化减小。

4.2. 丹皮酚提取响应曲面法实验

4.2.1. 丹皮酚提取率拟合回归模型的建立

按照实验设计(表2),采用design-expert软件进行多元回归拟合:以丹皮酚的提取率(Y)为响应值,各因子与响应值之间的回归方程为:Y = −1.11 + 0.04A + 0.01B + 0.07C + 5.89 × 10−5AB + 1.09 × 10−3AC + 4.3 × 10−4BC − 2.61 × 10−4A2 − 1.25 × 10-4B2 − 3.91 × 10−2C2 (R2 = 0.9905)。

Table 2. Design and results of the three-variable/three-level response surface method

表2. 响应面法实验设计与结果

Figure 2. Effect of ethanol concentration on paeonol extract yield

图2. 乙醇浓度对丹皮酚提取率的影响

Figure 3. Effect of extract temperature on paeonol extract yield

图3. 提取温度对丹皮酚提取率的影响

Figure 4. Effect of extract time on paeonol extract yield

图4. 提取时间对丹皮酚提取率的影响

4.2.2. 回归方程显著性分析

表3可以看出,乙醇浓度、提取温度和时间对丹皮酚的提取率分别具有极显著(P < 0.01)。回归模型方程的决定系数R2 = 0.9905,变异系数1.46,失拟项不具有显著差异(P > 0.05),说明实验拟合度高,误差小,实验具有可靠性,能用于乙醇提取丹皮酚工艺的分析优化。

4.2.3. 响应曲面分析

响应面优化与预测:依据二维等高线和三维响应面,当设定Y最大时,丹皮酚最佳提取工艺。此时

Table 3. Analysis of significant difference of the regression equation

表3. 回归方程显著性分析

注:*表明显著性差异(P < 0.05);**表明极显著性差异(P < 0.01)。

Figure 5. 3D-response surface curves of different two factors including ethanol concentration, extract temperature and extract time on paeonol extract yields

图5. 乙醇浓度、提取温度、提取时间各两因素对丹皮酚提取率的三维响应面曲线

乙醇浓度77.5%,提取温度50℃,提取时间2 h,提取率92.3%。结果见图5

5. 结论

目前丹皮酚由于具有显著的抗炎活性,在国内医药市场上已得到广泛应用,但是提高和优化丹皮酚的提取纯化工艺,对丹皮酚原料市场具有重要意义。本实验通过单因素和响应曲面实验,研究了丹皮中丹皮酚的提取工艺并进行了优化,得出用77.5%乙醇浓度、50℃提取温度、2 h提取时间和料液比30:1 (mL/g)时,丹皮酚的提取率达到92.3%,该提取工艺稳定可靠,能应用于工业化生产。

参考文献

文章引用: 杨 桐 (2018) 基于Box-Behnken设计–响应曲面法优化丹皮酚的提取工艺。 生物医学, 8, 7-15. doi: 10.12677/HJBM.2018.82002

参考文献

[1] Chou, T.C. (2003) Anti-Inflammatory and Analgesic Effects of Paeonol in Carrageenan-Evoked Thermal Hyperalgesia. British Journal of Pharmacology, 139, 1146-1152.
https://doi.org/10.1038/sj.bjp.0705360

[2] Huang, T.J., Chuang, H., Liang, Y.C., Lin, H.H., Horng, J.C., Kuo, Y.C., Chen, C.W., Tsai, F.Y., Yen, S.C., Chou, S.C. and Hsu, M.H. (2015) Design, Synthesis, and Bioevaluation of Paeonol Derivatives as Potential Anti-HBV Agents. European Journal of Medicinal Chemistry, 90, 428-435.
https://doi.org/10.1016/j.ejmech.2014.11.050

[3] Nizamutdinova, I.T., Jin, Y.C., Kim, J.S., Yean, M.H., Kang, S.S., Kim, Y.S., Lee, J.H., Seo, H.G., Kim, H.J. and Chang, K.C. (2008) Paeonolprotects Rat Heart by Improving Regional Blood Perfusion during No-Reflow. Planta Medica, 74, 8.

[4] Chen, B., Ning, M. and Yang, G. (2012) Effect of Paeonol on Antioxidant and Immune Regulatory Activity in Hepatocellular Carcinoma Rats. Molecules, 17, 4672-4683.
https://doi.org/10.3390/molecules17044672

[5] Lau, C.H., Chan, C.M., Chan, Y.W., Lau, K.M., Lau, T.W., Lam, F.C., Law, W.T., Che, C.T., Leung, P.C., Fung, K.P., Ho, Y.Y. and Lau, C.B.S. (2007) Pharmacological Investigations of the Anti-Diabetic Effect of Cortex Moutan and Its Active Component Paeonol. Phytomedicine, 14, 778-784.
https://doi.org/10.1016/j.phymed.2007.01.007

[6] Kim, H.K., Tak, J.H. and Ahn, Y.J. (2004) Acaricidalactivity of Paeonia suffruticosa Root Bark-Derived Compounds against Dermatophagoides farinae and Dermatophagoides pteronyssinus (Acari:  Pyroglyphidae). Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52, 7857-7861.
https://doi.org/10.1021/jf048708a

[7] 邵作敏. 牡丹皮中丹皮酚提取工艺优化及药理作用的研究[D]: [硕士学位论文]. 合肥: 安徽农业大学, 2014.

[8] 朱琳琳, 李玉贤. 丹皮酚超声提取工艺研究[J]. 中医学报, 2011(6): 713-714.

[9] 赵连飞, 陈凤丽, 孙曦晓, 等. 牡丹种壳中丹皮酚和芍药苷的微波提取及含量测定[J]. 植物研究, 2014, 34(4): 561-566.

[10] 韦丽佳, 杨宗发. 从牡丹皮中提取丹皮酚工艺研究[J]. 现代医药卫生, 2008, 24(8): 1153-1154.

[11] 张云升, 成晓迅, 和健, 等. 牡丹皮中丹皮酚的提取工艺研究[J]. 河北省科学院学报, 2005, 22(3): 49-51.

[12] 彭晓霞, 路莎莎. 响应面优化法在中药研究中的应用和发展[J]. 中国实验方剂学杂志, 2011, 17(19): 296-299.

[13] Khuri, A.I. and Mukhopadhyay, S. (2009) Response Surface Methodology. Springer Texts in Statistics, 1, 1171-1179.

[14] 国家药典委员会编. 中华人民共和国药典(一部) [M]. 北京: 中国医药科技出版社, 2015.

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